科学的演化往往遵循一种“提出—回答—再提出—再回答”的螺旋式探索规律。对于初入学术生涯的研究生们而言，尽快理解这种看似“永无尽头”的探索之路是非常必要的，否则将很可能在自卑与自负的情绪纠缠中蹉跎了宝贵的在校时光。

       下面我以亲身经历的一项工作来解读这种恼人却又让人兴奋的探索历程。

       原文链接（请置于“阅读原文链接”）： 

       https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0043135419303860

背景

       长期以来人们坚信厌氧氨氧化细菌通过化能自养的方式生存，它们仅利用无机碳（CO2或者HCO3-）作为其碳源。自养型的生长方式限制了厌氧氨氧化细菌在自然环境和工程系统中与异养微生物竞争的能力。因此，很多人认为厌氧氨氧化工艺不适合处理COD含量较高的废水——因为有机物会抑制厌氧氨氧化细菌的生长。

       上面的这些观点在我刚刚接触厌氧氨氧化研究的年代深入人心。那一年是2008年，我在高大文教授的指导下开始读硕士。

       通过深入调研文献，我发现2002—2005年间发表的几篇文章认为小分子有机物不会直接抑制厌氧氨氧化细菌。2006年Nature发表的一篇基于宏基因组学分析的研究暗示：厌氧氨氧化细菌具备代谢短链脂肪酸的潜力。

图一 2006年Nature发表的一篇对厌氧氨氧化研究具有深远意义的论文

寻找铁证

       找到厌氧氨氧化细菌代谢短链脂肪酸的铁证非常困难。厌氧氨氧化细菌极难被纯培养，我们只能通过富集培养获得尽可能高纯度厌氧氨氧化细菌等混合菌群。许多经典的检测方法（例如利用同位素比质谱仪检测气体组成来反推代谢途径）并没办法排除“杂菌”的干扰。寻求“眼见为实”的铁证成了我那几年心心念念的梦。

       转机出现在2012年。我在参加哥本哈根ISME大会期间参观了NanoSIMS仪器厂家的展台。这种“高级质谱”能够以惊人的分辨率让人“看”到同位素在微观尺度下的分布情况，包括细胞。受此启发，我想，如果在底物中加入13C标记的短链脂肪酸，再去培养厌氧氨氧化细菌，岂不是有可能直接看到13C究竟能否在厌氧氨氧化细菌细胞内积累？交流中得知，那时候大陆只有一台NanoSIMS，在中科院地质与地球物理研究所。

图二 我在中科院地质与地球物理研究所纳米离子探针实验室拍摄到了一张NanoSIMS分析图片。这是一个吸收了大量13C的厌氧氨氧化细菌的细胞（图三中与此相似的为15N图）。我很喜欢这颗“浪漫的彗星”。

       2013年冬天我在代尔夫特理工大学生物技术系的办公室与Gijs Kuenen老先生详细讨论了我寻求铁证的想法。老先生很兴奋，他说：“厌氧氨氧化研究一直有两个迷思——氮和碳（的代谢途径）。Mike（Jetten）他们做得很好，把氮的途径分析得越来越清楚了。我跟他说过好多次，要搞搞碳，他总躲闪，说太难了。”

       Gijs给了我很多关于实验设计的建议，后来还把Mark叫上一起帮我们。于是，回国后（2014年）我们便开启了寻找铁证之旅。

我们以为“问题解决了”

       我的同门黄晓丽博士经过不懈的尝试终于获得了相对丰度高达96%的混菌体系，其中厌氧氨氧化细菌以Jettenia asiatica为主。我们用13C标记后的乙酸和丙酸以及15N标记的NH4Cl来培养它们，然后用NanoSIMS对切片进行扫描。

图三 厌氧氨氧化细菌单细胞富集短链脂肪酸的实验设计思路。

       NanoSIMS扫描结果显示，Jettenia asiatica能够吸收乙酸和丙酸分子，并且效率非常高，比无机底物（碳酸氢盐）培养的效率高出十倍左右！我们很快完成了初稿并发给Gijs和Mark。他们跟我们一样兴奋，肯定了我们的重大发现。我们迅速组织一篇拟投Science的文章。

新问题来了

图四 NanoSIMS图像显示Jettenia asiatica细胞吸收了大量13C标记的乙酸和丙酸，以及15N标记的NH4Cl。详细内容可阅读原文。

       收到初稿后，Gijs给我们泼了冷水——Jettenia asiatica吸收了乙酸和丙酸分子，那后来呢？这些小分子有机物被直接利用合成细胞，还是首先被氧化为CO2再合成细胞物质？换句话说，“异养厌氧氨氧化”到底存不存在？

       “这是一个更重要的问题！”Gijs坦言道。

       很遗憾，我们当时没办法正面回答这个问题。

       Science的四位审稿人在一致肯定已有结果的重要性之余，不约而同地提出了跟Gijs相似的看法，最终拒稿。

正视创新的价值

       过了一段时间，Mark提出：“铁证如山的结果对厌氧氨氧化研究而言，意义足够明显了。”我们最终把成果发表在Water Research上，没有提及“异养厌氧氨氧化”，而是谨慎的分析道“乙酸或丙酸可能不是直接被Jettenia asiatica吸收和利用，而是先被氧化为二氧化碳，二氧化碳作为细胞后续自养的碳源。此外，尽管提供了完全相同数量的13C原子，但丙酸培养下的Jettenia asiatica吸收的15N比相同条件下乙酸培养下吸收得更多。”

       我们的研究表明，厌氧氨氧化细菌除了化能自养外，还有一种可选择的营养方式，即有机营养型。我们正式创新的水平和价值，提出厌氧氨氧化细菌在自然生态系统和工程系统中的生态位比传统所知要广泛得多。认识到这一点，厌氧氨氧化细菌在全球污水处理和全球氮循环中的作用可能更加重要。

       目前，越来越多的研究者在深入解析厌氧氨氧化细菌的多种代谢途径，为揭开它的碳迷思提供佐证。

尾声

       上面这个小故事中充满了曲折，我曾一度兴奋不已，也曾坠入失望。现在看来，这是科研道路上必经的过程。

       对同学们而言，我有三个小建议：（1）广泛调研文献、深度阅读论文在科研初期非常关键；（2）能寻求铁证如山就不要兜兜转转，这是做实验科学的捷径！（3）要与同行们进行深度合作，摒弃我执，谦虚倾听大家的建议。

       以上，与大家共勉。

       陶彧，哈尔滨工业大学（深圳）副研究员，英国帝国理工学院博士后副研究员，国家公派荷兰代尔夫特理工大学联合培养博士研究生。本硕博皆毕业于哈尔滨工业大学环境科学与工程专业。主要从事厌氧消化及厌氧氨氧化微生物（组）研究。回国后聚焦水系统暗信息的识别与分析工作。目前担任Environmental Science and Ecotechnology期刊编辑部主任，中国工程院院刊Engineering土木水利建筑工程学科青年编委，中国城镇供水排水协会青年工作者委员会委员。发表学术论文五十余篇（其中中科院一区论文三十余篇），被引1600余次；H因子/年龄比为0.75。